Antybakteryjne działanie nanocząstek srebra – wpływ na strukturę i funkcje komórek bakteryjnych

Postępująca antybiotykooporność mikroorganizmów i brak nowych skutecznych cząsteczek terapeutycznych niosą za sobą konieczność poszukiwania kolejnych efektywnych terapii antybakteryjnych. Wśród strategii alternatywnych dla antybiotyków dużym zainteresowaniem cieszą się nanocząstki srebra, AgNPs (ang. silver nanoparticles). Charakteryzują się one dużym stosunkiem powierzchni do objętości i wykazują właściwości biologiczne już w bardzo małych stężeniach. AgNPs mają duży potencjał antybakteryjny, jednak mechanizm ich działania nie został jeszcze w pełni poznany. Celem niniejszego projektu doktorskiego było uzupełnienie tego stanu wiedzy poprzez dostarczenie informacji o antybakteryjnym działaniu nanocząstek srebra na strukturę i funkcje komórek wybranych gatunków bakterii. Część eksperymentalna pracy składała się z pięciu zagadnień, stanowiących szczegółowe zadania badawcze. Określono i) wpływ nanosrebra na tworzenie i eradykację biofilmów, żywotność tworzących je komórek, skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz ich strukturę przestrzenną; ii) wpływ AgNPs na czynniki wirulencji P. aeruginosa; iii) działanie nanocząstek srebra na osłony komórek bakterii L. monocytogenes; iv) zdolność AgNPs do indukcji odpowiedzi stresowej; v) interakcje nanosrebra z konwencjonalnymi antybiotykami. Badania prowadzono na szczepach referencyjnych bakterii patogennych: K. pneumoniae, P. aeruginosa, L. monocytogenes, S. aureus. Koloid nanocząstek srebra, syntetyzowany opatentowaną metodą fizyczną, otrzymano z firmy Nanotech (Polska). Uzyskane wyniki jednoznacznie potwierdziły silny antybakteryjny potencjał analizowanego preparatu nanocząstek srebra. W toku analiz wpływu nanocząstek srebra na biofilmy wykazano hamowanie adhezji do polistyrenowego podłoża, związane z tym zmiany w hydrofobowości powierzchni komórek, oraz zaburzenia w tworzeniu biofilmów, szczególnie widoczne w przypadku badanych bakterii gramujemnych. Analizy mikroskopowe wskazały na znaczne różnice w strukturze przestrzennej biofilmów P. aeruginosa i S. aureus hodowanych w obecności sub-inhibitorowych stężeń AgNPs i dowiodły zmian w morfologii komórek gramujemnego szczepu wywołanych obecnością nanosrebra. Stwierdzono również zdolność nanocząstek do eradykacji biofilmów P. aeruginosa i K. pneumoniae utworzonych na powierzchni silikonowych cewników Foleya. W badaniach efektu działania AgNPs na czynniki wirulencji P. aeruginosa zaobserwowano zmniejszoną zdolność szczepu do ruchu pływającego i rozpełzliwego w obecności nanosrebra. Oba typy ruchu mają związek z tworzeniem biofilmów przez ten patogen, szczególnie na wstępnych etapach kolonizacji nowych nisz środowiskowych. Kolejne analizy wykazały niewielkie hamowanie syntezy/sekrecji sideroforu, piowerdyny, przez nanocząstki srebra. 2 Wpływ nanosrebra na osłony L. monocytogenes przejawiał się zwiększeniem stopnia autolizy komórek indukowanej lizozymem lub Tritonem X-100 oraz niewielkim wzrostem tempa autolizy wyizolowanej mureiny. AgNPs zmieniały też przepuszczalność osłon komórkowych, co może świadczyć o uszkodzeniu osłon komórkowych przez nanosrebro. Określono także wpływ AgNPs, jako czynnika stresowego, na odpowiedź szoku cieplnego w komórkach bakterii P. aeruginosa i L. monocytogenes. Wyznacznikiem odpowiedzi była ilość wybranych białek szoku cieplnego (DnaK, DnaJ, HtpG, IbpA, IbpB) w komórkach bakterii poddanych działaniu subletalnych stężeń AgNPs. Istotny wzrost ilości białka DnaK zaobserwowano jedynie w komórkach P. aeruginosa poddanych działaniu nanocząstek srebra w porównaniu z hodowlą kontrolną. Ostatnie zagadnienie badawcze wiązało się z określeniem interakcji między nanocząstkami srebra i wybranymi, klasycznymi antybiotykami. W testach szachownicy na płytkach titracyjnych obserwowano synergię z ampicyliną, streptomycyną, tetracykliną i ryfampicyną, jedynie wobec komórek P. aeruginosa. Następujące analizy kinetyki przeżywalności bakterii, potwierdziły oddziaływania synergistyczne w kombinacji AgNPs ze streptomycyną. Podsumowując, koloid nanosrebra stosowany w pracy wykazuje duży potencjał antybakteryjny. Dużo silniejsze działanie obserwuje się jednak względem komórek bakterii gramujemnych niż gramdodatnich. Szeroko zakrojone analizy efektów przeciwbakteryjnego działania świadczą o plejotropowym mechanizmie działania nanosrebra. Uzyskane wyniki wskazują przy tym, że oddziaływanie nanocząstek z osłonami komórek ma duże znaczenie dla obserwowanego efektu antybakteryjnego.

The growing antibiotic resistance to microorganisms and the lack of new effective therapeutic molecules are the cause of search for novel antimicrobial therapies. Among the alternative strategies for antibiotics, of great interest are silver nanoparticles (AgNPs), clusters of atoms with a diameter of 1 to 100 nm. They have a high surface to volume ratio and exhibit biological properties even in extremely low concentrations. AgNPs show great antibacterial potential, but their mechanism of action has not yet been fully resolved. The aim of this doctoral project was to complement this knowledge by providing information about the antibacterial effect of silver nanoparticles on bacterial cells, their structure and functions. Experimental work consisted of five specific research tasks. I studied: i) the effect of nanosilver on biofilm formation and eradication, cells survival, matrix composition and biofilm structure; ii) the impact of AgNPs on P. aeruginosa virulence factors; iii) the effect of nanosilver on L. monocytogenes cells envelopes; iv) AgNPs ability to induce cellular stress response; v) interactions of nanosilver with conventional antibiotics. Reference strains of bacterial pathogens K. pneumoniae, P. aeruginosa, L. monocytogenes, S. aureus were used in the study. Silver nanoparticles colloid, synthesized by a patented physical method, was obtained from Nanotech (Poland). Already preliminary results clearly confirmed the strong antibacterial potential of the tested AgNPs. In the course of analysis, inhibition of bacterial adhesion to polystyrene and related changes in the hydrophobicity of the cells surface were observed. AgNPs hampered biofilm formation and reduced viability especially of the tested Gram-negative strains. Microscopic analysis showed significant differences in the structure of P. aeruginosa and S. aureus biofilms in the presence of AgNPs and demonstrated morphological changes in cells of the Gram-negative strain. Nanosilver was able to eradicate P. aeruginosa and K. pneumoniae biofilms formed on the surface of the silicone Foley catheters. In studies of the AgNPs effect on P. aeruginosa virulence factors, we observed a decreased ability of the strain to swimming and swarming motility in the presence of nanosilver. Both types of movement are associated with the formation of biofilms by the pathogen, especially in initial stages of the new environmental niches colonization. Additional tests of siderophore, pyoverdine, production revealed a minor inhibition of synthesis/secretion of this fluorescent dye. Effect of nanosilver on L. monocytogenes envelopes was demonstrated as an increase in the cell autolysis degree induced by lysozyme or Triton X-100, and a small increase in the rate of autolysis of isolated murein. Silver nanoparticles changed also the permeability of cell envelopes. These results may indicate the damage of cell envelopes by AgNPs. The effect of AgNPs as a stress factor, on the level of heat shock response in P. aeruginosa and L. monocytogenes cells was analysed by estimation of the level of selected heat shock proteins (DnaK, DnaJ, HtpG, IbpA, IbpB) in bacterial cells exposed to sublethal 2 concentrations of nanosilver. A significant increase in the amount of DnaK protein was observed only in cells of P. aeruginosa treated with silver nanoparticles compared to a control culture. The next research task was the determination of the interactions between silver nanoparticles and the selected conventional antibiotics. In standard chequerboard assay on microtiter plates, synergy was observed with ampicillin, streptomycin, rifampicin and tetracycline, only towards P. aeruginosa cells. The following analysis of the kinetics of bacterial survival confirmed the synergistic effects only in AgNPs and streptomycin combination. In summary, the colloid of nanosilver used in the work has a strong antibacterial potential. The effect is much more potent toward Gram-negative than Gram-positive bacteria cells. Extensive analyses of the AgNPs antibacterial activity indicate a pleiotropic mechanism of action. The results point the fact that the interaction of nanoparticles with cell envelopes is important for the observed antibacterial effect.