Badania nowych modyfikacji oraz optymalizacja procesu wytwarzania mRNA do zastosowań terapeutycznych

Rozwój narzędzi molekularnych opartych na technologii syntetycznych mRNA trwa nieprzerwanie od ponad 30 lat. Ciągłe udoskonalanie metod wytwarzania, przechowywania oraz dostarczania kwasów nukleinowych do komórek pacjenta przyczyniło się do rozpowszechnienia procedur medycznych opartych na RNA, w tym szczepionek mRNA oraz terapii genowych. Głównym problemem, który wciąż nie został w pełni rozwiązany, jest niska stabilność RNA. W warunkach fizjologicznych mRNA jest stosunkowo szybko degradowane, a proces ten zwykle inicjowany jest na końcowych fragmentach cząsteczki. Naturalne mRNA posiada struktury ochronne na obu końcach, regulujące jego degradację i chroniące regiony kodujące. Większość dojrzałych mRNA eukariontów zawiera na końcu 5’ strukturę kapu (czapeczkę), która chroni przed 5’-egzonukleazami i wspomaga translację. Na końcu 3’ znajduje się ogon poli(A), który zabezpiecza cząsteczkę przed degradacją od tego końca, zwiększając jej stabilność i uczestnicząc w procesie translacji. Współdziałanie tych struktur jest kluczowe dla efektywnej translacji i regulacji stabilności mRNA w komórkach eukariotycznych, co ma istotne znaczenie dla potencjalnych zastosowań terapeutycznych. W ostatnich latach opracowano szereg nowych metod modyfikacji mRNA, które znacząco poprawiły jego aktywność biologiczną, stanowiąc fundament dla terapii przeciwnowotworowych oraz dalszych badań w tym zakresie. Moja praca doktorska skupia się na rozwoju tych technologii oraz ich potencjalnym zastosowaniu. Pierwsza część mojej rozprawy dotyczy opracowania biofizycznej metody badania interakcji syntetycznych mRNA z białkiem IFIT1. Technika termoforezy mikroskalowej umożliwiła precyzyjną analizę oddziaływań molekularnych, co pozwoliło na zrozumienie mechanizmów rozpoznawania RNA przez ludzki układ immunologiczny. Badania objęły ponad czterdzieści RNA z różnymi modyfikacjami strukturalnymi w regionie końca 5’. Wyniki pozwoliły określić wpływ modyfikacji chemicznych na interakcje z IFIT1 oraz scharakteryzować wzorce tych oddziaływań. Drugą część mojej pracy poświęciłem opracowaniu metody detekcji dwuniciowych RNA (dsRNA) w preparatach mRNA. Cząsteczki dsRNA są silnymi czynnikami immunogennymi, co może prowadzić do niepożądanych reakcji immunologicznych u pacjentów. Opracowany szybki i czuły immunotest typu dot-blot umożliwił ocenę zawartości dsRNA w preparatach mRNA, co jest kluczowe dla kontroli jakości tych terapeutycznych produktów. Trzecia część mojej rozprawy skoncentrowana była na modyfikacjach strukturalnych w regionie ogona poli(A) mRNA. Moje badania miały na celu zwiększenie stabilności tej sekwencji na poziomie DNA oraz poprawę potencjału translacyjnego mRNA. Zaprojektowane konstrukty genetyczne, zawierające różnorodne układy heteronukleotydowe, zostały ocenione pod względem ich biologicznej aktywności in vitro oraz in vivo, co pozwoliło na identyfikację najbardziej obiecujących modyfikacji z potencjałem terapeutycznym. Opracowane przeze mnie metody i modyfikacje mają na celu udoskonalenie technologii mRNA, otwierając nowe perspektywy dla terapii genowych oraz innych zastosowań medycznych. Ich wdrożenie może przyczynić się do zwiększenia skuteczności i bezpieczeństwa terapii opartych na mRNA, co jest kluczowe dla rozwoju medycyny molekularnej w przyszłości.

The development of molecular tools based on synthetic mRNA technology has been ongoing for over 30 years. The continuous improvement of methods for producing, storing, and delivering nucleic acids to patient cells has contributed to the widespread use of RNA-based medical procedures, including mRNA vaccines and gene therapies. The main problem that remains unresolved is the low stability of RNA. Under physiological conditions, mRNA is relatively rapidly degraded, with this process typically initiated at the terminal regions of the molecule. Natural mRNA has protective structures at both ends that regulate its degradation and protect the coding regions. Most mature mRNAs in eukaryotes have a cap structure at the 5’ end, which protects against 5’-exonucleases and supports translation. At the 3’ end, there is a poly(A) tail that protects the molecule from degradation at this end, increasing its stability and participating in the translation process. The interaction between these structures is crucial for efficient translation and the regulation of mRNA stability in eukaryotic cells, which is essential for potential therapeutic applications. In recent years, a number of new mRNA modification methods have been developed, significantly improving its biological activity and laying the foundation for cancer therapies and further research in this field. My doctoral research focuses on the development of these technologies and their potential applications. The first part of my dissertation involves the development of a biophysical method for studying the interactions of synthetic mRNA with the IFIT1 protein. The technique of microscale thermophoresis enabled precise analysis of molecular interactions, helping to understand the mechanisms of RNA recognition by the human immune system. The study included over forty RNA molecules with various structural modifications at the 5’ end. The results allowed the identification of the impact of chemical modifications on interactions with IFIT1 and the characterization of the patterns of these interactions. The second part of my research focused on developing a method for detecting double-stranded RNA (dsRNA) in mRNA preparations. dsRNA molecules are strong immunogenic factors that can trigger unwanted immune responses in patients. The rapid and sensitive dot-blot immunoassay I developed allowed the assessment of dsRNA content in mRNA preparations, which is crucial for quality control of these therapeutic products. The third part of my dissertation focused on structural modifications in the poly(A) tail region of mRNA. My research aimed to increase the stability of this sequence at the DNA level and improve the translational potential of mRNA. The genetic constructs designed, containing various heteronucleotide arrangements, were evaluated for their biological activity both in vitro and in vivo, which allowed for the identification of the most promising modifications with therapeutic potential. The methods and modifications I developed aim to improve mRNA technology, opening new prospects for gene therapies and other medical applications. Their implementation could contribute to enhancing the efficacy and safety of mRNA-based therapies, which is crucial for the future development of molecular medicine.