Praca doktorska
Synteza i właściwości analogów trimetylokapu znakowanych fluorescencyjnymi molekularnymi rotorami
| dc.abstract.en | The trimethylguanosine (TMG) cap is a motif present at the 5’ end of small nuclear and nucleolar RNAs, which are involved in RNA splicing. The TMG cap plays a crucial role in RNA processing and stability as it protects the RNA molecule from degradation by exonucleases and facilitates its export from the nucleus. In the cytoplasm in each cell the TMG cap plays a role in the recognition of snRNA by snurportin, a protein that initiates nuclear import formatting also complex with importin β. TMG cap analogs have been used as affinity resins in protein separation and purification from extracts or as nuclear localization signal for improving nuclear import of some polar and large biomolecules (DNA, streptavidin), however they can be used also in biochemical experiments and biological assays as molecular tools to substitute the natural TMG capped RNAs. The main aim of my work was synthesis, physicochemical (free compounds) and bio-physical characterization (complexed) of a series of dinucleotide TMG cap analogs and their conjugates with Fluorescent Molecular Rotors (FMR) in experiments with snurportin both in vitro and in cells. This functionalization was intended to open the possibility of detecting snurportin–ligand interactions in vitro and potentially in vivo. I have obtained large set (over 50) of final compounds with FMRs in different positions and different nucleotides part and evaluated as molecular probes for snurportin. Some compounds have been additionally modified either in bridging region (methylenebisphosphonate, CH2), by elongating to tetra-phosphate or at 5’-O positions by changing O to S. These modifications were expected to ensure resistance to enzymatic degradation by human Nudt16 and/or maintain or enhance affinity towards snurportin. Among FMRs five GFP-like chromophores (derived from green fluorescent protein) and two julolidine derivatives have been tested. The evaluation of binding affinities for snurportin showed unexpectedly a strongly stabilizing effect for TMGpppG-derived dinucleotides contain-ning the GFP-like FMR at the 2’-O-position of guanosine. These newly discovered compounds are potent snurportin ligands with nanomolar KD (dissociation constant) values, which are two orders of magnitude lower than that of natural TMGpppG. The effect is diminished by ∼50-fold for the corresponding 3’-regioisomers. To deepen the understanding of the structure–activity relationship, I have synthesized and tested FMR conjugates lacking the TMG cap moiety, which revealed, that this newly observed effect persist also in m7G caps and in less extend in GMP analogs, yet with unspecific interactions (ie. m7G cap-FMR conjugates were proved to bind competitively also with eIF4E). These experimental studies, have been supported by molecular docking, and both suggest, that the enhanced affinity arises from additional hydrophobic contacts provided by the GFP-like FMR moiety regardless of functional groups in phenyl ring. The strongest snurportin ligand, which also gave the greatest fluorescence enhancement (Fm/F0) when saturated with the snurportin, were tested in living cells to detect interactions and visualize complexes by monitoring fluorescence lifetimes. This approach has potential applications in the study of RNA processing and RNA– protein interactions which is also discussed. Finally, 9 TMG cap-FMR conjugates have been identified in my studies as potent and specific snurportin ligands and among them 4 conjugates with DMHBI as FMR has shown beneficial fluorescence properties in complexes in vitro, meanwhile one exemplary conjugate from these have been tested in living cells and has been found to associate in complexes comparable in sizes with snurportin. |
| dc.abstract.pl | Czapeczka trimetyloguanozyny (TMG kap) to motyw obecny na końcu 5' małych jądrowych i jąderkowych RNA, które biorą udział w m.in. splicingu RNA. Struktura TMG kapu odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu i stabilności RNA, ponieważ chroni cząsteczkę RNA przed degradacją przez egzonukleazy i ułatwia jej eksport z jądra. W cytoplazmie każdej komórki czapeczka TMG odgrywa rolę w rozpoznawaniu snRNA przez snurportynę, białko, które inicjuje formatowanie importu jądrowego, a także kompleksuje z importyną β. Analogi czapeczki TMG były stosowane jako żywice powinowactwa w separacji i oczyszczaniu białek z ekstraktów lub jako sygnał lokalizacji jądrowej w celu poprawy importu jądrowego niektórych polarnych i dużych biocząsteczek (DNA, streptawidyna), jednak mogą być również stosowane w eksperymentach biochemicznych i testach biologicznych jako narzędzia molekularne do zastępowania naturalnych RNA zakończonym kapem TMG. Głównym celem mojej pracy była synteza, fizykochemiczna (wolne związki) i biofizyczna charakterystyka (kompleksy białko-nukleotyd) serii dinukleotydowych analogów kap TMG i ich koniugatów z Fluorescencyjnymi Rotorami Molekularnymi (FMR) w eksperymentach ze snurportyną zarówno in vitro, jak i w komórkach. Ta funkcjonalizacja miała na celu otwarcie możliwości wykrywania interakcji snurportyna–ligand in vitro i potencjalnie in vivo. Uzyskałem duży zestaw (ponad 50) końcowych związków z FMR w różnych pozycjach i z różnymi strukturami nukleotydów. Oceniłem ich przydatność jako sondy molekularne dla snurportyny. Niektóre związki zostały dodatkowo zmodyfikowane albo w regionie mostkowym (metylenobisfosfonian, CH2), przez wydłużenie do tetrafosforanu lub w pozycjach 5’-O przez zmianę O na S. Oczekiwano, że te modyfikacje zapewnią odporność na degradację enzymatyczną przez ludzkiego Nudt16 i/lub utrzymają lub wzmocnią powinowactwo do snurportyny. Wśród FMR przetestowano pięć chromoforów podobnych do GFP (pochodzących z zielonego białka fluorescencyjnego) i dwie pochodne julolidyny. Ocena powinowactwa wiązania dla snurportyny nieoczekiwanie wykazała silnie stabilizujący efekt dla dinukleotydów pochodzących z TMGpppG zawierających GFP-podobny FMR w pozycji 2’-O guanozyny. Te nowo odkryte związki są silnymi ligandami snurportyny z nanomolowymi wartościami KD (stałej dysocjacji), które są o dwa rzędy wielkości niższe niż w przypadku naturalnego TMGpppG. Efekt jest zmniejszony o ~50-krotnie dla odpowiadających im 3’-regioizomerów. Aby pogłębić zrozumienie zależności między strukturą a aktywnością, zsyntetyzowałem i przetestowałem koniugaty FMR pozbawione fragmentu kapu TMG, co ujawniło, że ten nowo zaobserwowany efekt utrzymuje się również w kapach m7G i w mniejszym stopniu w analogach GMP, ale z niespecyficznymi interakcjami (tj. udowodniono, że koniugaty kapu m7G-FMR wiążą się konkurencyjnie również z eIF4E). Te badania eksperymentalne zostały poparte dokowaniem molekularnym i oba sugerują, że zwiększone powinowactwo wynika z dodatkowych hydrofobowych kontaktów zapewnianych przez fragment FMR podobny do GFP, niezależnie od grup funkcyjnych w pierścieniu fenylowym. Najsilniejszy ligand snurportyny, który również dawał największe wzmocnienie fluorescencji (Fm/F0) po nasyceniu snurportyną, został przetestowany w żywych komórkach w celu wykrycia interakcji i wizualizacji kompleksów poprzez monitorowanie czasów życia fluorescencji. To podejście ma potencjalne zastosowania w badaniu przetwarzania RNA i interakcji RNA-białko, które również są omawiane. Wreszcie w moich badaniach zidentyfikowano 9 koniugatów TMG cap-FMR jako silne i specyficzne ligandy snurportyny, a wśród nich 4 koniugaty z DMHBI jako FMR wykazały korzystne właściwości fluorescencyjne w kompleksach in vitro, a jeden przykładowy koniugat z nich został przetestowany na żywych komórkach i stwierdzono, że łączy się w kompleksy o porównywalnych rozmiarach ze snurportyną. |
| dc.affiliation | Uniwersytet Warszawski |
| dc.affiliation.department | Uniwersytet Warszawski |
| dc.contributor.author | Surynt, Piotr |
| dc.date.accessioned | 2025-05-13T04:00:01Z |
| dc.date.available | 2025-05-13T04:00:01Z |
| dc.date.defence | 2025-06-09 |
| dc.date.issued | 2025 |
| dc.date.submitted | 2025-02-07 |
| dc.description.promoter | Jemielity, Jacek |
| dc.description.reviewer | Plażuk, Damian |
| dc.description.reviewer | Huczyński, Adam |
| dc.description.reviewer | Grudziński, Wojciech |
| dc.description.reviewer | Jemielity, Jacek |
| dc.identifier.apd | 228294 |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/166400 |
| dc.language | pl |
| dc.language.other | en |
| dc.publisher | Uniwersytet Warszawski |
| dc.subject.en | TMG |
| dc.subject.en | trimethylguanosine |
| dc.subject.en | cap |
| dc.subject.en | fluorescent molecular rotors |
| dc.subject.en | snurportin |
| dc.subject.en | GFP |
| dc.subject.en | DMHBI |
| dc.subject.en | dinucleotides |
| dc.subject.en | ligands |
| dc.subject.en | affinity |
| dc.subject.en | conjugates |
| dc.subject.en | in vitro and in vivo interactions |
| dc.subject.pl | TMG |
| dc.subject.pl | trimetyloguanozyna |
| dc.subject.pl | kap |
| dc.subject.pl | fluorescencyjne molekularne rotory |
| dc.subject.pl | snurportyna |
| dc.subject.pl | GFP |
| dc.subject.pl | DMHBI |
| dc.subject.pl | dinukleotydy |
| dc.subject.pl | ligandy |
| dc.subject.pl | powinowactwo |
| dc.subject.pl | koniugaty |
| dc.subject.pl | interakcje in vitro i in vivo |
| dc.title | Synteza i właściwości analogów trimetylokapu znakowanych fluorescencyjnymi molekularnymi rotorami |
| dc.title.alternative | Synthesis and properties of trimethyl cap analogs labelled with fluorescent molecular rotors |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |