Structure and lipid membrane interaction of influenza hemagglutinin fusogenic and transmembrane domains

Grypa jest chorobą układu oddechowego znaną już od czasów starożytnych. Wywoływana jest przez wirusa grupy, który wnika do komórki gospodarza wykorzystując fuzę swojej otoczki lipidowej z błoną komórkową gospodarza. Proces ten jest kontrolowany przez homotrimeryczne białko wirusa, hemaglutyninę (HA). W niniejszej pracy doktorskiej przeprowadziłem badania nad strukturą i funkcją HA, w szczególności obejmujące jej elementy oddziałujące z błonami biologicznymi. Fuzja błon jest koordynowana przez podjednostkę 2 HA (HA2), która po aktywacji wprowadza swoje N-końcowe domeny fuzyjne (HAfps) do docelowej błony lipidowej, a następnie zginając się ruchem nożycowym przybliża ją do błony wirusowej i inicjuje mieszanie się lipidów. W trakcie całego procesu HA2 pozostaje zakotwiczona poprzez domenę transbłonową (TMD) i ogon cytoplazmatyczny (CT) w błonie wirusowej. Pomimo wielu lat badań nad reorganizacją strukturalną HA, szczegółowa wiedza na temat jej funkcji, w tym rola trimeryzacji HA, opis oddziaływania HAfps z błoną lipidową, zdolność HA do ułożenia się w stosunkowo wąskiej przestrzeni międzybłonowej oraz mechanizm działania HAfps, TMD i CT podczas procesu fuzji pozostaje nieuchwytna. W pierwszym etapie pracy doktorskiej przeprowadziłem niepodejmowane do tej pory pełnoatomowe symulacje dynamiki molekularnej (MD), których celem było zbadanie struktury trimerycznej N-końcowego fragmentu HA2. W środowisku wodnym trimery HAfps okazały się tworzyć zwarte, hydrofobowe agregaty, co sugeruje ich jednoczasowe wprowadzenie do błony gospodarza raczej niż sekwencyjne, indywidualne insercje. W środowisku błonowym HAfps przyjmują konformację spinki do włosów, o konfiguracji powierzchniowej lub transbłonowej, przy czym ta druga powoduje znaczne zwiększenie stopnia zaburzenia struktury błony. Zaobserwowałem również efekt synergii w obrębie trimerów HAfps o konfiguracji transbłonowej, polegający na tworzeniu osiowo symetrycznych asocjatów z centralnym kanałem wodnym, które utrzymują się wewnątrz dwuwarstwy lipidowej z większą stabilnością niż formy monomeryczne, prowadząc do utrwalenia defektu strukturalnego błony. W kolejnej części pracy skupiłem się na mechanizmie fuzji błon lipidowych kontrolowanym przez HAfp. W oparciu o nowatorskie, pełnoatomowe symulacje MD wspomagane próbkowaniem parasolowym z uogólnioną współrzędną reakcji pozwalającą precyzyjnie kontrolować przebieg łączenia się dwóch dwuwarstw lipidowych uzyskałem potencjały średniej siły dla wstępnego etapu procesu fuzji katalizowanego przez HAfp. Wyniki moich badań wskazują na możliwość istnienia dwóch mechanizmów zależnych od orientacji HAfp w błonie docelowej. Pierwszy z nich zakłada udział konfiguracji transbłonowej HAfp, która tworząc defekt strukturalny błony stabilizuje tworzący się w pobliżu międzybłonowy mostek lipidowy dzięki relaksacji krzywizny jego powierzchni. Drugi mechanizm obejmuje ułożenie HAfp na powierzchni błony lipidowej w konformacji spinki do włosów i opiera się na jego zdolności do podtrzymywania hydrofobowego mostka lipidowego poprzez przyjęcie orientacji prostopadłej do płaszczyzny błon i utworzenie molekularnego, sztywnego rusztowania, które chroni hydrofobowy rdzeń przed kontaktem z wodą obecną w przestrzeni międzybłonowej. W ostatniej części pracy skupiłem się na zbadaniu C-końcowej domeny HA2. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką plastyczność strukturalną TMD oraz potencjalne sprzężenie pomiędzy jej konfiguracją, a orientacją ektodomeny HA2. Symulacje wykazały preferencję dla prostopadłej do błony lipidowej orientacji ektodomeny HA2, gdy TMD przyjmuje konfigurację wyprostowaną i jej tendencję do pochylania się po przejściu TMD do konfiguracji skośnej. Wyznaczone potencjały średniej siły dla przejść TMD pokazują, iż względna stabilność obu konfiguracji jest zależna od zawartości cholesterolu w błonie, przy czym kluczowy dla realizacji obserwowanego bimodalnego zachowania TMD okazuje się być pozornie obojętny fragment CT, który zapewnia prawidłowe osadzenie TMD w błonie wirusowej. Badania nad mechanizmem fuzji błon lipidowych są kluczowe dla zrozumienia podstawowych zjawisk zachodzących w komórkach. Scharakteryzowany przeze mnie molekularny opis procesu fuzji błon kontrolowany przez HA pozwolił uzyskać niedostępny dotąd wgląd w funkcję modelowego białka fuzyjnego na poziomie pełnoatomowym.

Influenza is a respiratory system disease known since ancient times. It is caused by an influenza virus that penetrates the host cell in order to replicate. This process occurs through the fusion of viral and host cell membranes, facilitated by the influenza virus's homotrimeric fusion protein, hemagglutinin (HA), present on its surface. In this doctoral dissertation, I conducted research on the structure and function of HA, particularly focusing on its components interacting with biological membranes. Membrane fusion is coordinated by the HA subunit 2 (HA2), which upon activation inserts its N-terminal fusion domains (HAfps) into the target lipid membrane. By a jackknife-like motion, HA2 brings the endosomal and viral membranes into close proximity and initiates lipid mixing. Throughout this process, HA2 remains anchored via its transmembrane domain (TMD) and cytoplasmic tail (CT) in the viral membrane. Despite years of research on the structural rearrangement of HA, detailed knowledge regarding its function, including the role of HA trimerization, HAfps interaction with the target lipid membrane, HA ability to fit into a relatively narrow intermembrane space, and the mechanism of action of HAfps, TMD, and CT during fusion process, remains elusive. In the first stage of my doctoral project, I conducted all-atom molecular dynamics (MD) simulations, aimed at investigating the structure of the trimeric N-terminal HA2 fragment. In an aqueous environment, HAfps trimers were found to form compact, hydrophobic aggregates, suggesting their simultaneous introduction into the host membrane rather than sequential, individual insertions. In the membrane environment, HAfps adopt a hairpin conformation, remaining either in surface or transmembrane configuration, with the latter causing significant disruption of the membrane structure. I also observed a synergy effect within transmembrane HAfps trimers, involving the formation of axially symmetric associates with a central water channel, which persist within the lipid bilayer with greater stability than monomeric forms, leading to the consolidation of membrane structural defects. In the subsequent part of my doctoral project, I focused on the mechanism of lipid bilayer fusion controlled by HAfp. Based on fully atomistic MD simulations aided by umbrella sampling with a generalized reaction coordinate, allowing the control over the fusion of two membranes, I obtained potentials of mean force for the initial stage of the fusion process. The results of my research indicate the possibility of two mechanisms dependent on the localization of HAfp in the target membrane. The first assumes the involvement of a transmembrane HAfp configuration, which by creating a structural defect in the membrane, stabilizes the emerging intermembrane lipid bridge through relaxation of its surface curvature. The second mechanism involves surface-bound HAfp hairpin and relies on its ability to support a hydrophobic lipid bridge by adopting a perpendicular orientation to the membrane plane and forming a molecular, rigid scaffold that protects the hydrophobic core from contact with the water present in the intermembrane space. In the final part of my doctoral project, I focused on investigating the C-terminal HA2 domain. The obtained results indicate a high structural plasticity of TMD and potential coupling between its configuration and the orientation of the HA2 ectodomain. Simulations showed a preference for a perpendicular orientation of the HA2 ectodomain to the lipid bilayer when the TMD adopts a straight configuration and its tendency to tilt after the TMD transitions to a tilted configuration. The PMFs for TMD transitions indicate that the relative stability of both configurations depends on the cholesterol content in the membrane, with a seemingly neutral CT fragment proving crucial for realizing the observed bimodal behavior of TMD by ensuring its proper embedding in the viral membrane. Research on the mechanism of lipid membrane fusion is crucial for understanding fundamental phenomena occurring within cells. The molecular studies of the membrane fusion process controlled by HA conducted within this doctoral project has provided previously unavailable insight into the function of the model fusion protein at the fully atomistic level.