Analiza architektury kompleksu CCR4-NOT i mechanizmu jego działania w szlaku mikroRNA

Końce eukariotycznych cząsteczek mRNA są na terenie cytoplazmy zabezpieczone przed degradacją przez strukturę 5'-kapu oraz ogon poli(A) dołączany do ich 3'-końca. Białka PABP wiążące ogon poli(A) oddziałują ponadto z czynnikami inicjacji translacji eIF4E/eIF4G wiążącymi strukturę 5'-kapu. Prowadzi to do cyrkularyzacji transkryptu, która stabilizuje taki kompleks rybonukleoproteinowy i wzmacnia jego translację. Pierwszym etapem degradacji cząsteczki mRNA jest więc zablokowanie oddziaływania ze sobą jej końców poprzez skrócenie ogona poli(A) (deadenylacja przez kompleksy CCR4-NOT oraz PAN2-PAN3) lub usunięcie struktury 5'-kapu przez kompleks DCP2-DCP1. Kompleks CCR4-NOT jest główną eukariotyczną deadenylazą i odpowiada za pierwsze etapy degradacji większości mRNA na terenie cytoplazmy. Jest on silnie zachowany ewolucyjnie i składa się z przynajmniej dwóch niezależnych modułów funkcjonalnych oddziałujących z jego największą podjednostką, białkiem CNOT1. Dwie podjednostki katalityczne (CNOT6/CNO6L oraz CNOT7/CNOT8) wiążą się razem z białkiem CNOT9 do N-końcowej części białka CNOT1, podczas gdy pozostałe białka NOT (CNOT2 oraz CNOT3) oddziałują z jego C-końcową częścią.Kompleks CCR4-NOT jest również powiązany ze szlakiem posttranskrypcyjnego wyciszania genów przez mikroRNA. miRNA są krótkimi, 22 nukleotydowymi cząsteczkami RNA, które po wbudowaniu w kompleksy RISC (RNA-induced silencing complex) wyciszają ekspresję wybranych genów. Wiążą się one do komplementarnych sekwencji znajdujących się w obszarze 3'-UTR określonych transkryptów i powodują ich degradację oraz represję translacji. Kluczową rolę odgrywają przy tym białka z rodziny GW182. Ich N-końcowa domena wiąże się do kompleksów RISC, podczas gdy ich C-końcowa domena SD/CED (silencing domain/C-terminal effector domain) odpowiada za wyciszanie transkryptów. Oddziałuje ona bezpośrednio z białkami odpowiedzialnymi za degradację mRNA, w tym z kompleksem CCR4-NOT, ale molekularny mechanizm tego oddziaływania nie jest znany. By zbadać oddziaływania pomiędzy podjednostkami kompleksu CCR4-NOT w układzie in vitro oraz mechanizm jego rekrutacji do transkryptów wyciszanych na szlaku miRNA, wybrane podjednostki ludzkiego kompleksu CCR4-NOT oraz fragmenty białek GW182 oczyszczono wykorzystując ekspresję heterologiczną w bakteriach E. coli. Oddziaływania pomiędzy rekombinowanymi białkami zbadano wykorzystując analizę wielokątowego rozpraszania światła sprzężoną z sączeniem molekularnym (SEC-MALS). Dzięki niej wykazano, że za wiązanie podjednostki CNOT7 odpowiada centralnie położona domena MIF4G białka CNOT1, natomiast podjednostka CNOT9 oddziałuje z sąsiadującą z nią domeną CN9BD. Analizy przeprowadzone na drożdżowych ortologach podjednostek CNOT2 i CNOT3 wykazały ponadto, że białka te oddziałują ze sobą poprzez C-końcowe domeny NOT-box. Systematyczna analiza oddziaływań pomiędzy podjednostkami i modułami kompleksu CCR4-NOT a domeną SD/CED ludzkich białek GW182 umożliwiła ustalenie dwóch obszarów odpowiedzialnych za jego rekrutację do transkryptów związanych przez kompleksy RISC. Znajdują się one na powierzchni podjednostki CNOT9 oraz w obrębie modułu NOT złożonego z C-końców białek CNOT1, CNOT2 oraz CNOT3. Wiązanie kompleksu CCR4-NOT przez białka GW182 jest ponadto zależne od łańcuchów bocznych tryptofanów znajdujących się w nieustrukturyzowanych obszarach domeny SD/CED. Powyższe wyniki pozwalają lepiej zrozumieć architekturę kompleksu CCR4-NOT oraz wyjaśniają molekularny mechanizm jego rekrutacji do wyciszanych transkryptów przez białka z rodziny GW182.

Eukaryotic mRNA are protected from degradation from both ends by the cap structure and poly(A) tail at their 5' and 3' ends, respectively. Moreover, the PABP proteins (poly(A) binding proteins) associated with poly(A) tail interact with the translation factors eIF4E/eIF4G that protect the 5' cap structure. This mRNA circularization stabilizes such mRNP (mRNA-protein complexes) and results in the enhancement of translation. Therefore, the first step in mRNA degradation is destabilization of the interaction between 5'- and 3'-ends by reducing the length of poly(A) tail (deadenylation by the CCR4-NOT and PAN2-PAN3 protein complexes) and/or removal of the 5'-cap structure by the DCP2-DCP1 decapping complex.The CCR4-NOT complex is the major eukaryotic deadenylase and is involved in cytoplasmic degradation of most mRNA molecules. This evolutionarily conserved multiprotein assembly consists of at least two distinct functional and structural modules that are connected by the large scaffold protein CNOT1. The two catalytic subunits (CNOT6/CNOT6L and CNOT7/CNOT8) together with the CNOT9 protein interact with the N-terminal part of CNOT1 protein, while the CNOT2 and CNOT3 proteins associate with the C-terminal part of CNOT1. Recently it was shown that CCR4-NOT complex is involved in microRNA-mediated mRNA repression. Central to this pathway are small, 22 nt long RNA called miRNA. They are complementary to short sequences present in 3'-UTR (untranslated region) of many transcripts. After incorporation into RNA-induced silencing complexes (RISC) miRNA guide them to those mRNA. This generally leads to translational repression and subsequent degradation of targeted transcripts. Major players in this process are GW182 proteins. They are recruited to miRNA targets through their N-terminal domains, while their C-terminal part, called silencing domain (SD) or C-terminal effector domain (CED), is directly responsible for silencing. The SD/CED domain may directly recruit deadenylase complexes and presumably other degradation factors by interacting with CNOT1 protein, but the exact mechanism of GW182 action remains elusive. To get insights into architecture of the CCR4-NOT complex and to identify its subunits that are directly involved in the interaction with GW182 proteins a series of truncated versions of CNOT1 protein and other subunits of the human CCR4-NOT complex were purified from E. coli expression cells. Recombinant proteins were tested for interaction with each other and with SD/CED domain of human GW182 proteins by size-exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering (SEC-MALS). These experiments showed that the CNOT7 catalytic subunit interacts with the central domain of CNOT1 protein called MIF4G while the CNOT9 subunit is bound to the adjacent CN9BD domain. Moreover, experiments conducted with yeast orthologues of CNOT2 and CNOT3 subunits showed that they interact with each other through their C-terminal NOT-box domains. SEC-MALS analysis of CCR4-NOT subunits mixed with SD/CED domain showed that the GW182 proteins recruit the major deadenylase complex by interacting with the CNOT9 subunit. This interaction is mediated by hydrophobic Trp residues scattered throughout the unstructured parts of SD/CED sequence and is further stabilised by additional binding surface located on the NOT-module of the CCR4-NOT complex. Collectively, these results provide new insights into the architecture of the CCR4-NOT complex and explain mechanism of its recruitment by GW182 proteins.