Bioprospecting of lignocellulolytic microorganisms and their enzymes for valorization of waste biomass

Biomasa lignocelulozowa jest cennym substratem, który coraz częściej jest wykorzystywany do wytwarzania bioproduktów o wysokiej wartości dodanej. Jednym z wyzwań związanych z opłacalnością konwersji biomasy lignocelulozowej jest usprawnienie jej enzymatycznej hydrolizy, którą utrudnia heterogeniczna struktura tej biomasy. Niniejsza praca miała na celu dostarczenie mikrobiologicznych rozwiązań usprawniających biotransformację biomasy lignocelulozowej podczas wstępnej obróbki i hydrolizy. W pierwszym etapie pracy wyizolowano i przeprowadzono optymalizację bioprocesową dla dwóch szczepów grzybów: Aspergillus fumigatus ZS_AF i Penicillium fuscoglaucum JAM-1. Szczepy te zostały wybrane ze względu na ich zdolność do produkcji enzymów hydrolitycznych (w tym celulaz, ksylenaz i β-glukozydaz) podczas suchej fermentacji substratów lignocelulozowych. Szczep A. fumigatus ZS_AF, wyizolowany z nieczynnej kopalni złota w Złotym Stoku, efektywnie produkował enzymy podczas hodowli na podłożu na bazie trocin sosnowych, podczas gdy P. fuscoglaucum JAM-1, wyizolowany z odpadów owocowych, wykorzystywał śrutę rzepakową i trociny sosnowe. Dla szczepu Aspergillus fumigatus ZS_AF przeprowadzono optymalizację produkcji enzymów za pomocą metody powierzchni odpowiedzi (ang. response surface methodology, RSM), co pozwoliło na dwukrotny wzrost wydajności ich produkcji. Uzyskano następujące wartości dla karboksymetylocelulazy (CMCase - carboxy methyl cellulase), ksylanazy, β-glukozydazy i FPazy (filter paper cellulase): 119,41 U/gds, 1232,23 U/gds, 63,19 U/gds i 31,08 U/gds. Z kolei, analiza porównawcza z wykorzystaniem metody “jeden czynnik w czasie” (ang. constant one variable at a time, COVT) przeprowadzona dla P. fuscoglaucum JAM-1 wykazała, że na śrucie rzepakowej osiągane są dużo wyższe wartości produkcyjne (odpowiednio dla ksylanazy 612 U/gds, β-glukozydazy 264 U/gds, endoglukanazy 102 U/gds, FPazy 21,3 U/gds i egzo-poligalakturonazy 49,17 U/gds) niż na trocinach.,. Szczegółowa analiza sekretomu A. fumigatus ZS_AF potwierdziła kluczową rolę enzymów z grupy CAZymes (carbohydrate-active enzymes) i enzymów pomocniczych w waloryzacji biomasy. W puli enzymów z grupy CAZymes zidentyfikowano hydrolazy glikozydowe (66%), esterazy węglowodanowe (9%), enzymy pomocnicze (3%) i liazy polisacharydowe (3%). Analiza sekretomu P. fuscoglaucum JAM-1, pozwoliła na identyfikację 435 i 120 białek, odpowiednio dla hodowli prowadzonej na śrucie rzepakowej i trocinach sosnowych. Spośród wszystkich białek, 153 CAZymy były specyficzne dla śruty, 38 dla trocin; a17 było wspólnych dla obu sekretomów. Dla obu substratów zidentyfikowane CAZymy zawierały głównie białka degradujące celulozę, w tym endoglukanazy (GH5, GH7), β-glukozydazy (GH1, GH3, GH17) oraz celobiohydrolazy (GH6, GH7), enzymy degradujące hemicelulozę takie jak endo-1,4-ksylanaza (GH10), α/β galaktozydaza (GH27, GH35, GH36), α/β-mannosydazy (GH38, GH2, GH47, GH5) oraz α-L arabinoferanazy (GH43, GH62, GH51, GH54), a także enzymy aktywności pomocniczej rozkładu węglowodanów, takie jak AA9 (wcześniej znany jako GH61) lityczna monooksygenaza polisacharydowa (LPMO). Aplikacja tych różnorodnych i wielofunkcyjnych enzymów pochodzących od A. fumigatus ZS_AF do dekompozycji wstępnie zalkalizowanej biomasy (słomy i trocin) pozwoliła na uzyskanie wysokich stężeń cukrów redukujących (wyrażonych w mg na g biomasy) wynoszący odpowiednio 675,36 mg/g i 410,15 mg/g. Podsumowując, zastosowanie takich różnorodnych i wielofunkcyjnych enzymów pochodzących z hodowli jednego mikroorganizmu stanowi wydajne i praktyczne rozwiązanie, eliminujące potrzebę stosowania długotrwałych metod oczyszczania pojedynczych enzymów. W kolejnym etapie pracy podjęto wyzwanie dotyczące ograniczeń dekompozycji biomasy lignocelulozowej związanych z jej strukturą. Pomimo traktowania enzymami takimi jak endoglukanazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy, celuloza często pozostaje w stanie krystalicznym. Te enzymy głównie atakują amorficzną celulozę, pozostawiając część krystaliczną nienaruszoną. Jednym z rozwiązań tego problemu jest zastosowanie litycznych monooksygenaz polisacharydowych (LPMO), które degradują także krystaliczną celulozę. W tej części pracy sklonowano trzy geny kodujące różne LPMO (CcLPMO1, CcLPMO2 i CcLPMO3) uzyskane z genomu bakterii Cellulosimicrobium cellulans PW. Po ekspresji genów i oczyszczeniu uzyskanych produktów przeprowadzono ich charakterystykę. Wszystkie trzy monooksygenazy wykazały wysoką termostabilność (70 °C) i tolerancję na szeroki zakres pH (5,0-9,0) oraz specyficzność substratową względem celulozy i chityny. Badane enzymy wykazały także synergistyczne działanie wraz z komercyjnymi celulazami (Cellic CTec2) zwiększając o 80% ich wydajność do produkcji cukrów redukujących, przy jednoczesnej redukcji krystalicznej części celulozy. Te termostabilne enzymy wydają się być wysoce efektywne w tworzeniu mieszanek enzymatycznych do przemysłowej obróbki biomasy lignocelulozowej. Dodatkowym zagadnieniem rozważanym przy poszukiwaniu zrównoważonych i ekologicznych alternatyw dla konwencjonalnej katalizy chemicznej jest immobilizacja enzymów stanowiąca atrakcyjną strategię do zniwelowania ograniczeń jednorazowego użycia i szybkiej utraty aktywności. Dlatego, w kolejnym etapie pracy przeanalizowano sposób immobilizacji kowalencyjnej z użyciem glutaraldehydu jako środka sieciującego. Wykorzystano do tego celu zeolit typu Faujasite (FAU-typ) Na-X, który stanowił matrycę stałą do immobilizacji enzymów. Unieruchomienie celulaz na zeolitcie Na-X pozwoliło osiągnąć efektywność immobilizacji na poziomie 73% i wydajność 77%. W porównaniu do wolnych enzymów, immobilizowana celulaza wykazała szerszą stabilność pH (5,0-9,0), optymalną temperaturę działania 60 °C oraz trzykrotnie dłuższy czas połowicznego rozpadu (t1/2) w temperaturze 60 °C. Zachowała ponad 80% resztkowej aktywności po 5 cyklach ponownego użycia. Dodatkowe analizy strukturalne (SEM, XRD, FTIR) potwierdziły jej efektywność katalityczną w waloryzacji odpadów lignocelulozowych. W ostatnim etapie pracy sprawdzono możliwość zastosowania konsorcjum grzybów składającego się z A. fumigatus ZS_AF, P. fuscoglaucum JAM-1 i Trichoderma deliquescens TE (przygotowanego do komercyjnego użycia, certyfikowanego i zarejestrowanego biopreparatu B Decomposer) do kompostowania mieszaniny odpadów biomasy odpadowej (słomy pszenicznej) i osadów ściekowych. Badania w skali pilotażowej w warunkach rzeczywistych wykazały, że dodanie biopreparatu grzybowego (B-Decomposer) wspomaga kompostowanie i poprawia właściwości kompostu poprzez zmniejszenie zawartości wilgoci i promowanie wysokiego poziomu mineralizacji materii organicznej podczas fazy kompostowania. Podsumowując, przeprowadzone prace pozwoliły dostarczyć mikrobiologiczne narzędzia i metody do pełniejszego wykorzystania i zagospodarowania biomasy lignocelulozowej. Z wykorzystaniem izolatów środowiskowych A. fumigatus ZS_AF i P. fuscoglaucum JAM-1 wykazano wydajną produkcję celulaz i hemicelulaz w warunkach fermentacji stałej lignocelulozowej biomasy odpadowej. Aplikacja uzyskanych w ten sposób mieszanek enzymów pozwoliła na efektywną hydrolizę substratów lignocelulozowych i uzyskanie wysokich zawartości cukrów redukujących. W pracy wykazano, że w celu zwiększenia wydajności rozkładu celulozy można wykorzystać synergistyczny efekt LPMO (litycznych monooksygenaz polisacharydowych) w połączeniu z innymi hydrolazami. Ponadto, przeprowadzono testy immobilizacji enzymów, wykazując większą stabilnością i możliwością ponownego użycia. Dodatkowo, w ostatnim etapie pracy wykazano, że konsorcjum grzybów zawierające wyizolowane szczepy ZS_AF i JAM-1, może znaleźć praktyczne zastosowanie w przyspieszaniu rozkładu biomasy lignocelulozwej w procesach kompostowania. Zaproponowane podejście, nie tylko maksymalizuje wykorzystanie zasobów, ale także przyczynia się do zrównoważonego rozwoju środowiska.

Lignocellulosic biomass (LCB) has emerged as a robust resource that offers a sustainable alternative for generating value-added bioproducts. However, the heterogeneous structure of LCB poses challenges in biomass conversion, particularly in enzymatic hydrolysis, which limits the cost-effectiveness of converting LCB. This study aims to provide microbiological solutions for overcoming significant challenges in lignocellulosic biorefinery processes, particularly related to the inherent recalcitrance of lignocellulosic biomass during pretreatment and hydrolysis stages. The current research focuses on meticulously isolated, screened, and optimized two potent fungal strains: Aspergillus fumigatus ZS_AF and Penicillium fuscoglaucum JAM-1. These strains were deliberately chosen for their ability to produce hydrolytic enzymes (including cellulases, xylanases, and β-glucosidases) by utilizing lignocellulosic substrates. Specifically, A. fumigatus ZS_AF from an ancient Złoty Stok gold mine utilizes pine sawdust (PSD), while P. fuscoglaucum JAM-1, from fruit waste, employs rapeseed cake (RSC) and PSD via solid-state fermentation. In the case of ZS_AF, for optimization, using response surface methodology (RSM), a two-fold increase in production of CMCase, xylanase, β-glucosidase, and FPase was achieved, with yields 119.41 U/gds, 1232.23 U/gds, 63.19 U/gds, and 31.08 U/gds, respectively. Similarly, using constant one variable at a time (COVT), a comparative analysis was performed in the case of P. fuscoglaucum JAM-1 using RSC and PSD. P. fuscoglaucum effectively utilized RSC, resulting in improved xylanase (612 U/gds), β-glucosidase (264 U/gds), endoglucanase (102 U/gds), FPase activity (21.3 U/gds), and exo-polygalacturonase activity (49.17 U/gds), as compared to PSD. Additionally, the secretome profiling of both fungi confirmed the crucial role of carbohydrate active enzymes (CAZymes) and auxiliary enzymes in biomass valorization. In the case of A. fumigatus ZS_AF, a significant 77% of the secretome comprises CAZymes, including 66% of glycoside hydrolases, 9% of carbohydrate esterases, 3% auxiliary activities, and 3% polysaccharide lyases. Similarly, for P. fuscoglaucum JAM-1, secretome profiling unveiled a protein abundance totaling 435 and 120 proteins during the utilization of RSC and PSD, respectively. Of the total proteins, 153 and 38 were identified as CAZymes using RSC and PSD, with 17 being common in both secretomes. Predominantly, both substrates contain CAZymes that consist of cellulose-degrading proteins, including endoglucanases (GH5, GH7), β-glucosidases (GH1, GH3, GH17), and cellobiohydrolases (GH6, GH7), hemicellulose-degrading enzymes such as endo-1,4-xylanase (GH10), α/β-galactosidase (GH27, GH35, GH36), α/β-mannosidases (GH38, GH2, GH47, GH5), and α-L-arabinofuranosidase (GH43, GH62, GH51, GH54), and carbohydrate-active auxiliary activities enzymes, such as AA9 (formerly known as GH61) lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO). This indicates that significant enhancements in saccharification were achieved through the diverse array of hydrolases and auxiliary enzymes present in the secretome of both A. fumigatus ZS_AF and P. fuscoglaucum JAM-1. Lastly, saccharification of pretreated wheat straw and PSD using A. fumigatus ZS_AF resulted in 675.36 mg/g and 410.15 mg/g, reducing sugar yields, respectively. These multifunctional enzymes, derived from a single microbe, offer an efficient and practical solution, eliminating the need for lengthy purification methods. Another challenge posed by the recalcitrant structure of lignocellulosic biomass lies in its cellulose polysaccharides. Despite treatment with enzymes such as endoglucanases, cellobiohydrolases, and β-glucosidases, cellulose often remains in a crystalline state. These enzymes primarily target amorphous cellulose, leaving the crystalline portion less affected. To tackle this issue, three LPMOs encoding genes (CcLPMO1, CcLPMO2, and CcLPMO3) obtained from the bacterial strain Cellulosimicrobium cellulans PW genome were cloned and heterologically expressed. After purification, all three enzymes exhibited higher thermostability at 70 °C and a wide pH range (5.0-9.0). With superior efficiency for cellulose degradation, they adeptly break down colloidal chitin, resulting in dual specificity. The combination of LPMO with commercial cellulase (Cellic CTec2) led to an 80% surge in the yield of reducing sugar compared to using commercial cellulase alone. These thermostable enzymes are highly effective in formulating enzyme cocktails for the industrial processing of lignocellulosic biomass. In the next stage of the work, the issue considered with sustainable and eco-friendly alternatives to conventional chemical catalysis is that the immobilization of enzymes has been advocated as an attractive strategy to offset the limitations of single-use and rapid activity loss. A covalent immobilization process using glutaraldehyde as a cross-linking agent. Faujasite (FAU type) Na-X zeolite, a solid matrix used to immobilize cellulase enzymes, achieved an immobilization efficiency of 73% and a yield of 77%. Compared to free enzymes, the immobilized cellulase demonstrated improved pH stability (5.0–9.0), a temperature optimum of 60 °C, and a three-fold longer half-life (t1/2) enhancement at 60 °C. It retained over 80% residual activity after 5 repeated cycles of usage. Structural analyses (SEM, XRD, FTIR) supported its catalytic efficiency in valorizing lignocellulosic waste feedstocks. Finally, the applicability of a fungal consortium consisting of A. fumigatus ZS_AF, P. fuscoglaucum JAM-1, and Trichoderma deliquescens TE (in the form of a commercial, certified, and registered B-Decomposer biopreparation) in composting a mixture of waste biomass (wheat straw) and sewage sludge was also investigated. A pilot-scale study in real-world scenarios demonstrated that adding fungal biopreparation (B-Decomposer) aids composting and improves compost properties by reducing moisture content and promoting the highest level of organic matter mineralization during the composting phase. In conclusion, this study highlighted the effective use of abundant and recalcitrant lignocellulosic residues to produce hydrolytic enzymes through fungal cell factories. Due to their versatility and robustness, these enzymes hold significant potential for the cost-effective production of cellulases and hemicellulases under solid-state fermentation. Additionally, the bio transformation of waste residues becomes achievable through their enzymatic action. To enhance enzymatic saccharification, the synergistic effect of LPMOs was leveraged in combination with other hydrolases. This approach facilitated the development of robust enzyme cocktails for industrial lignocellulosic biomass processing. Also, in this study, exploration was conducted into the immobilization of enzymes, resulting in improved stability and reusability. These advancements offer promising solutions for sustainable biorefineries. In the final stage of the research, the consortium of fungi, including ZS_AF and JAM-1 strains, could be practically applied to accelerate the decomposition of lignocellulosic biomass during composting processes. Consider implementing composting as part of the process to enrich the soil and close the loop, creating a circular flow of resources. These approaches not only maximize resource utilization but also contribute to environmental sustainability.